Biokatalytiske kaskader muliggør fremstilling af det makrocykliske peptid Enlicitide

MSD's orale PCSK9-hæmmer, enlicitide-decanoat (MK-0616), er den første orale makrocykliske peptid-PCSK9-hæmmer, der demonstrerer væsentlig LDL-C-sænkning hos mennesker. Enlicitide blev udviklet fra en mRNA-visningsskærm af monocykliske peptider og efterfølgende stabiliseret gennem ikke-peptidiske tværbindinger for at generere en struktur omfattende tre fusionerede makrocykler. Dette komplekse octapeptid indeholder seks unaturlige og to proteinogene aminosyrer forbundet med 12 amidbindinger og en central seks-carbonkædelinker. Traditionel kemisk syntese kræver 43 trin, beskyttelsesgruppemanipulationer (næsten halvdelen af ​​de syntetiske trin), kromatografiske oprensninger og et stærkt fortyndet rutheniumkatalyseret metatesetrin med ringlukning, hvilket begrænser skalerbarhed og bæredygtighed.

Kemoenzymatisk fremstillingsudvikling

MSD-forskerne udviklede en kortfattet og konvergent kemoenzymatisk proces til fremstilling af enlicitidecanoat (1) muliggjort ved direkte kobling af monomerer med aminosyreligaser, kombineret med biokatalytisk peptidfragmentligering og makrocykliseringer ved hjælp af esteraser og iminreduktaser.

Nøglepræstationer

Tre-enzym kaskade samling ved hjælp af ATP-greb ligaser

- Tre-enzymkaskade (to konstruerede ATP-grebsligaser + ATP-genbrug) samler et tetrapeptid fra ubeskyttede aminosyrer. ATP-grebsligaser (specifikt ATP-afhængige aminosyreligaser, AAL'er) er enzymer, der katalyserer amidbindingsdannelse mellem ubeskyttede aminosyrer eller peptider ved hjælp af ATP som energikilde. Deres mekanisme fortsætter gennem et blandet anhydridmellemprodukt, som tillader direkte kobling uden behov for beskyttelsesgrupper på den nukleofile amin eller aktiverede acyldonorer. I denne undersøgelse brugte forskerne en ATP-grebsligase fra Bifidobacterium adolescentis (BaAAL) og konstruerede varianter (Trp-BaAALEng og Phe-BaAALEng) til selektivt at udvide et dipeptid med to ikke-naturlige aminosyrer (tryptophan og phenylalanin-analoger) i en kaskade med én pot. Disse ligaser har en smal, nedgravet elektrofillomme, der accepterer enkelte aminosyrer som elektrofiler (C-terminale substrater), men kan rumme længere peptider som N-nukleofiler. Denne selektivitet gør dem ideelle til sekventiel, beskyttende gruppefri peptidsamling fra C-terminalen til N-terminalen. Den forbrugte ATP genbruges ved hjælp af en polyphosphatkinase (FbPPKWT) med billig hexametaphosphat som fosfatdonor.

Konstrueret esterase (RsEstEng) regioselektiv makrolactamisering

- Konstrueret esterase (RsEstEng) katalyserer regioselektiv makrolactamisering til dannelse af Northern-fragmentet (73 % udbytte, 52 kg skala). RsEstEng er afledt af en vildtype carboxylesterase (RsEst) identificeret fra Roseibacillus sp. Dens native funktion er hydrolyse af esterbindinger. Gennem rettet evolution konverterede forskerne det til en katalysator for regioselektiv makrolactamisering - dannelsen af ​​en makrocyklisk amidbinding - i syntesen af ​​det nordlige fragment (4) af enlicitide. Den accepterer den stabile, voluminøse tert-butylester af det lineære tetrapeptid (9) som acyldonoren for at producere det makrocykliske peptid (4) til dannelse af en intramolekylær amidbinding. Det opnåede selektiv ringslutning uden påviselige oligomerer og kun 0,8 % esterhydrolysebiprodukt, selv under de høje ionstyrkebetingelser fra den tidligere enzymatiske kaskade.

Konstrueret thioesterase (BlTEEng) intermolekylær ligering

- Konstrueret thioesterase (BlTEEng) udfører intermolekylær ligering af nordlige (4) og østlige fragmenter (3) uden epimerisering. BlTEEng er en modificeret version af et thioesterase (TE) domæne, der oprindeligt var udskåret fra den ikke-ribosomale peptidsyntetase (NRPS) af Brevibacillus laterosporus (BlTE). Vildtype thioesteraser i NRPS-systemer katalyserer typisk makrocyklisering eller frigivelse af lineære peptider fra et bærerprotein via en thioesterbinding. De konstruerede varianter af BlTE viste en vis aktivitet, men favoriserede dimere biprodukter. Enzymteknik flyttede enzymet for at katalysere intermolekylær ligering ved hjælp af mere stabile isopropyloxoestere i stedet for de naturlige, hydrolytisk labile thioestere.

Fire-enzym kaskade reduktiv aminering makrocyklisering

- Fire-enzymkaskade (PsIREDEng, KsKREDEng og cofaktorgenbrugsenzymer StLDHWT, TvADHWT) opnår reduktiv amineringsmakrocyklisering til dannelse af en bicyklisk diamin (69 % udbytte, 46 kg skala). KsKREDEng er en konstrueret ketoreduktase fra Kyrpidia sp. Det katalyserer oxidationen af ​​en benzylalkoholforbindelse (10) til et forbigående aldehyd (11) afhængig af NAD+. PsIRED er en iminreduktase fra Pseudogymnoascus sp. Det er NADPH-afhængigt. PsIREDEng katalyserer den reduktive aminering af aldehydet (11) og den eksisterende amin til dannelse af den cykliske imin (12), efterfulgt af reduktion til den sekundære aminmakrocyklus (13). StLDHWT regenererer NAD+ til det oxidative trin ved at reducere pyruvat til lactat, mens TvADHWT regenererer NADPH til det reduktive trin ved at oxidere isopropanol til acetone.

Endelig makrocyklisering via manipuleret PBP thioesterase

- Kemisk kobling med Western-fragmentet (2), efterfulgt af manipuleret penicillin-bindende proteinthioesterase (SsPBP-TEEng), lukker den endelige makrocyklus ved høj koncentration (70 g/L) - overvinder den typiske fortyndingsbegrænsning (5 g/L i traditionel syntese). Den overordnede proces omfatter tre kaskadetrin, 7 konstruerede + 3 hjælpeenzymer, 39 % samlet udbytte, demonstration i multikilogramskala, >99 % renhed, ingen kromatografi og ingen beskyttelsesgrupper. Dette arbejde giver en bæredygtig, skalerbar plan for fremstilling af komplekse makrocykliske peptider, hvilket dramatisk reducerer antal skridt og spild, mens effektiviteten og patientadgangen forbedres.