01 F&U-baggrund og udfordringer
1.1 Lægemiddeludviklingsbaggrunden for MK-0616
Enlicitide Decanoate (også kendt som MK-0616) er den første fuldt de novo-designede orale makrocykliske peptid PCSK9-hæmmer beregnet til at reducere low-density lipoprotein-kolesterol (LDL-C) og behandle aterosklerotisk kardiovaskulær sygdom.
Som vist i figuren ovenfor omfatter klassiske eksempler på dette område foruden MK-0616 også antibiotikummet vancomycin (2), det kemoterapeutiske middel paclitaxel (3) og anticancerlægemidlet eribulin (4). De komplekse strukturer af forbindelser 2 og 3 betyder, at deres egentlige syntese stadig er afhængig af semisyntetiske metoder baseret på naturlige produkter; i modsætning hertil opnåede Eisai-teamet den samlede syntese af forbindelse 4 gennem mere end 60 trin, hvilket markerede en milepæl i syntesen af polyketidforbindelser.
Med hensyn til MK-0616 er dens kemiske struktur meget unik: det er det første molekyle, der er helt designet fra bunden (i stedet for at være afledt af naturlige kilder); desuden, som en daglig oral PCSK9-hæmmer beregnet til behandling af hjerte-kar-sygdomme snarere end til onkologi eller anti-infektionsapplikationer, vil dens globale efterspørgsel langt overstige efterspørgslen efter konventionelle innovative lægemidler, hvilket nødvendiggør produktion i en skala, der spænder fra hundredvis af kilogram til flere tons.
1.2 Syntetiske udfordringer og strategier
Den molekylære kompleksitet af MK-0616 stiller strenge krav til procesudvikling.
Strukturelle egenskaber: Selvom MK-0616 stammer fra et makrocyklisk peptid identificeret gennem screening af mRNA-displayteknologi, indeholder det 6 ikke-kanoniske aminosyrer (i alt 8 aminosyreenheder), en 37-leddet makrocyklus, en ammoniumsaltsidekæde (10) og et konventionelt ikke-peptid-gengivelsesfragment af fast peptidfase (13), ineffektiv, som illustreret nedenfor.
De centrale udfordringer, der skal løses
1、Stabiliteten af polære mellemprodukter (især for ammoniumsaltfragmenter, hvor modionen skal kontrolleres gennem hele processen)；
2、Selektiviteten af stor ringlukning (kræver optimering af samlingssekvensen blandt 10 blokke)；
3、Opskaleringsudfordringer (undgå kromatografisk oprensning; sørg for milligram-til-kilogram skalagennemløb)；
Derfor, den centrale beslutning foreslået af forskerne er som følger：
1、del-og-hersk：Prioriter konstruktionen af "Northern-fragmentet" (en 17-leddet ring sammensat af ikke-kanoniske aminosyrer i position 5, 6 og 7), og forenkle den makrocykliske spaltningsstrategi gennem retrosyntetisk analyse (f.eks. ved at vælge amidbindingen mellem position 5 og 8).
2、Terminal sidekæde introduktion：Det polære ammoniumsaltfragment (10) skal reserveres til det sidste installationstrin for at undgå udfordringer forbundet med mellemrensning.
3、Den fleksible anvendelse af syre–baseneutraliseringsreaktioner (RCM)：En n-hexan-bundet kæde dannes ved position 7–13; denne reaktion udviser fremragende ortogonalitet og kan udføres i flere trin.
Gennem denne række af strategier har forskere i sidste ende etableret en skalerbar syntetisk rute, der baner vejen for klinisk evaluering.02
02 Syntetisk strategi og optimering
Gennem analytiske undersøgelser udførte forskerne multi-trin, multi-generation optimering af det makrocykliske nøglefragment (det nordlige fragment) og optimerede samlingen af det sydlige fragment med det endelige produkt.
2.1 Multi-generationel optimering af det nordlige segment:
Første generation– 37 gentagelser
Syntesen af ikke-kanoniske aminosyrer (f.eks. 3-hydroxyprolin) udviser lav effektivitet, da den er afhængig af ineffektive ringslutningsreaktioner—såsom Dieckmann-kondensen—såvel som chiral opløsning; endvidere kræver denne proces flere runder af beskyttelsesgruppemanipulation og adskillige kromatografiske oprensninger, som illustreret i figuren nedenfor.
Alle disse faktorer begrænser storskalasyntesen af målfragmenter.
Anden generations synkronsystem
Et gennembrud blev opnået gennem biokatalyse: indførelsen af ketonreduktion (KRED) muliggjorde den yderst effektive og stereoselektive reduktion afβ-hydroxyestere; derudover blev manipuleret TrpB-enzym brugt til at syntetisere fluoreret tryptofan, hvorved behovet for chiral opløsning blev elimineret. Som et resultat blev antallet af syntetiske trin reduceret, og anvendelsen af beskyttelsesgrupper blev minimeret, som illustreret i figuren nedenfor.
Denne syntetiske vej til optimering af Northern-fragmentet er også blevet anvendt i klinisk udvikling; muligheder, der opstår fra den strukturelle strategi, har imidlertid skabt et behov for yderligere optimering af fragmentsyntesevejen.
For det første giver de vigtigste resultater vedrørende de tre senfase-krystallisationsmellemprodukter et kritisk punkt for renhedskontrol; derfor er det vigtigt at ændre den syntetiske rute for at opsnappe disse tre mellemprodukter.
For det andet anbefales det at udføre cyclotrimeriseringen af olefiner reaktionen så sent som muligt under synteseprocessen. Denne tilgang er baseret på den betragtning, at rutheniumkatalysatorer kan øge de samlede omkostninger ved benzotiuraminproduktion; udførelse af denne reaktion på det sidste trin af syntetisk rute kan således reducere omkostningerne betydeligt.
Derfor har dette lettet optimeringen af tredjegenerationstilgangen.
Tredje generations fælles trinsystem
Gennem enzymatisk hydroxylering oxideres L-prolin direkte til 3-hydroxyprolin med en stereoselektivitet på over 99:1; nøglemellemprodukter blev identificeret, såsom krystalliniteten af benzensulfonatsaltet, hvilket gjorde det muligt at undgå kromatografisk oprensning; modulær samling blev anvendt sammen med justeringer af aminosyrekoblingssekvensen og forenkling af beskyttelsesgruppestrategien, som illustreret i figuren nedenfor.
Det tredje generations syntetiske MK-0616 Northern-fragment adskiller sig fra fragmenterne syntetiseret i de foregående to generationer. Denne udvælgelse blev drevet af identifikationen af krystallinsk pentanoat 91, som mangler threonin-aminosyreresten (som skal inkorporeres senere under syntesen). Dette salt kan isoleres med højt udbytte og renhed og giver et meget stabilt mellemprodukt, der kan opbevares som et nøglemellemprodukt gennem hele synteseprocessen.
Gennem optimering i tredje generation kræver adskillelsen af det nydesignede Northern-fragment (91) nu kun 14 trin—kun en tredjedel af antallet af trin, der kræves til første generations syntese. Ydermere er det vigtigt at bemærke, at i tredjegenerationsprotokollen er den længste lineære sekvens blevet reduceret med mere end halvdelen, faldende fra 20 trin til 9 trin.
2.2 Optimering af det sydlige fragment
Første generation, bestående af 15 trin
Med udgangspunkt i råvarer indkøbt i store mængder fra kommercielle leverandører, repræsenterer 9-trinsprocessen den længste lineære sekvens, som vist i figuren nedenfor.
Anden generations synkronsystem
I anden generations syntese var det, der blev forbedret, ikke antallet af trin, men snarere den overordnede effektivitet og renhedskontrol, som illustreret i skemaet nedenfor. Efter tusindvis af forsøg blev et Southern blot-fragment kaldet leelaminsalt (99) identificeret.
Anvendelsen af disse to forbindelser er tidligere blevet påvist at tjene som ikke-chirale opløsningsmidler for carboxylsyrer; følgelig kan det krystallinske salt (99) overraskende opnås som et yderst rent stof, hvorved man undgår det omfattende præparative HPLC-arbejde, der kræves i den foregående generation af syntese.
2.3 Slutproduktmontage
Både førstegenerations Northern-fragmentet og det andet mellemprodukt af Southern-fragmentet kan let beskyttes for at give den lineære precursor 61, som vist i figuren nedenfor; imidlertid er udbyttet af cycloolefinmetateseproduktet meget lavt.
Uanset hvad brugte forskere med succes en anden sekvens, hvilket muliggjorde den første skalerbare syntese af MK-0616, som illustreret i skemaet nedenfor.
Den første generation af enaldehydsalte blev syntetiseret via en 63-trins proces, der begynder med installation af sidekæder på den molekylære kerne gennem højtydende amidering efterfulgt af SFC-oprensning; blandt disse trin repræsenterer trin 28 den længste lineære sekvens.
Anden generations slutproduktkombination er vist i figuren nedenfor.
Ved at optimere veje for både Northern og Southern fragmenter rettet mod målproduktet, kan begge tilgange anvende flade fragment krystallinske mellemprodukter til at gå videre til det sidste trin af syntesen.
Denne koblingsreaktion er tilstrækkelig ren til at fortsætte direkte til det næste trin under anvendelse af en rå reaktion.
Samlet set kræver anden generations syntetiske rute for MK-0616 43 trin, blandt hvilke 21 trin udgør den længste lineære sekvens. Denne sekvens reducerer både det samlede antal trin og længden af den længste lineære sekvens sammenlignet med førstegenerationsprocessen med en tredjedel.
03 Nøgleteknologisk innovation
En analyse af hele optimeringsprocessen afslører flere innovationer inden for nøgleteknologier, såsom:
1、Biokatalyseteknologi:KRED dynamisk kinetisk opløsning; TrpB enzymmedieret syntese af tryptophananaloger; direkte indføring af hydroxylgrupper via prolinhydroxylase; osv.
2. Krystallisationsdrevet oprensning: Flere mellemtrin—såsom methylsulfonatet af Northern blot-fragmenter eller leelaminsaltet af Southern blot-fragmenter—anvendes til at opnå krystallisationsoprensning, hvorved behovet for kromatografisøjler elimineres.
3. Ortogonal beskyttelsesgruppestrategi: fleksibel skift mellem beskyttelsesgrupper såsom Boc og Nosyl for at sikre selektiviteten af flertrinsreaktioner.
4. Grøn kemi overvejelser: reduktion af brugen af tungmetalkatalysatorer (f.eks. rutheniumkatalysatorer) og flytning af RCM-reaktionen til et senere trin for at sænke produktionsomkostningerne.
04 Resumé og Outlook
Dette papir demonstrerer en fleksibel integration af biokatalyse og kemisk syntese, samtidig med at den understreger den centrale rolle af krystalliseringsprocesser og vedtager en modulær designtilgang - og viser derved en systematisk metodologi, der spænder fra laboratorieudforskning til produktion i industriel skala. Dette arbejde repræsenterer et eksemplarisk tilfælde inden for kompleks molekylær syntese: det samlede antal trin blev reduceret fra 63 i førstegenerationsprotokollen til 43 i andengenerationsprotokollen, med udbytter øget med næsten 1.000 gange og muliggør gennemførligheden af tonskalaproduktion. Gennem hele processen lægges der strategisk vægt på krystallisationstrinnet, hvorved man undgår kromatografisk oprensning - en funktion, der gør den særdeles velegnet til produktion i tonskala. Desuden giver denne undersøgelse en teknisk skabelon for de syntetiske tilgange til andre komplekse makrocykliske peptider.
