Naturlige peptider er fremragende "molekylære nøgler" - de har høj affinitet, god selektivitet og lav toksicitet. De har dog i sagens natur tre store svagheder: De bliver let hugget op af proteaser, har svært ved at trænge igennem cellemembraner og bliver i kroppen i for kort tid. I løbet af de sidste tre årtier har farmaceutiske fagfolk systematisk adresseret disse mangler med en "værktøjskasse af specielle aminosyrer". Denne artikel bruger almindeligt sprog og et stort antal diagrammer til at guide CMC R&D-kolleger til at adskille og forstå denne værktøjskasse fra princip til implementering.
I. Hvorfor er naturlige peptider "Utilstrækkelige"
II. Oversigt over fem store modifikationsstrategier
III. N-methylering
IV. a-methylering og Aib
V. D-konfiguration aminosyrer
VI. Ikke-naturlige aminosyrer
VII. Omfattende case: Hvordan laves orale peptider
VIII. En hurtig referenceside for CMC Peers
IX. Fremtidige designtendenser: AI og skærmteknologi
Brug af et naturligt polypeptid (bestående udelukkende af 20 L-type aminosyrer) direkte som medicin varer ofte ikke i mere end et par minutter. Årsagen kan opsummeres i én sætning: Det menneskelige stofskiftesystem er i sagens natur designet til at genkende og nedbryde denne struktur. Det er specifikt manifesteret som fire indbyrdes forbundne spørgsmål.
①Proteasenedbrydning - Det mest dødelige plasma, lever, nyrer og mave-tarmkanal er fyldt med peptidaser/proteaser (såsom DPP-4, aminopeptidase, carboxypeptidase, trypsin osv.), som specifikt genkender L-type amidbindinger og hydrolyserer dem. Halveringstiden for naturlig GLP-1 i kroppen er kun omkring 1,5 til 2 minutter.
②Dårlig membranpermeabilitet og vanskelig oral administration: Den store mængde amid N-H på polypeptidskelettet er en stærk hydrogenbindingsdonor og er tæt pakket ind af vandmolekyler, hvilket gør det vanskeligt at passere gennem cellemembranens hydrofobe kerne. Dette er den grundlæggende årsag til, at langt de fleste peptider kun kan indgives ved injektion.
③Med en kort halveringstid og hurtig renal clearance filtreres polypeptider med lille molekylvægt (<5 kDa) hurtigt og renses af glomerulus. Sammen med enzymatisk hydrolyse er eksponeringsniveauet i kroppen vanskeligt at opretholde, og hyppig administration er påkrævet.
④Lineære polypeptider med konformationsfleksibilitet og dårlig selektivitet er som "bløde nudler" i opløsning, med utallige konformationer, der hurtigt vender. Ved binding til målet er entropitabet stort, affiniteten udelukkes, og det kan også fejlagtigt binde til flere relaterede receptorer, hvilket fører til off-target.
Den "særlige aminosyre"-strategi er i det væsentlige en præcis reparation af disse fire svage punkter: uden at forstyrre den farmakodynamiske konformation, modificerer den skelettet og sidekæderne, hvilket tillader molekylet at "undgå" enzymgenkendelse, "fjerne" overskydende hydrogenbindinger og "låse" den aktive konformation, samtidig med at målet bibeholdes så meget som muligt.
Brug først en tabel til at etablere en overordnet forståelse. De følgende fem typer modifikationer er de mest almindeligt anvendte "specielle aminosyrer"-metoder i moderne peptidlægemiddeldesign, og de vil blive uddybet én efter én i de efterfølgende kapitler.
N-methylering er processen med at erstatte hydrogenet (n-H) på nitrogenatomet i skeletamidbindingen med en methylgruppe (n-CH3). En tilsyneladende mindre ændring kan samtidigt udløse fire nøgleparametre for farmakokinetikken. Dens virkningsmekanisme kan opdeles i tre niveauer.
Hver N-H er en stærk hydrogenbindingsdonor, der "holder" molekylet i den vandige fase. N-methylering, der sletter denne donor, reducerer det polære overfladeareal (PSA) af molekylet, hvilket tillader molekylet at "dehydrere" og trænge ind i den hydrofobe kerne af membranen. N-methyleringseffekterne på flere steder kan overlejres - den klassiske Veber-Hirschmann somatostatinanalog har efter N-methylering på tre steder en oral biotilgængelighed på cirka 10%.
Methylgruppen optager pladsen nær amidbindingen. Den protease aktive lomme kan ikke korrekt "bide" spaltningsbindingen, hvorved den metaboliske stabilitet forbedres væsentligt. Dette er det fysiske grundlag, hvorpå N-methylering er direkte forbundet med resistens over for enzymatisk hydrolyse.
Almindelige amidbindinger er næsten alle trans (trans), mens N-methylering bringer energiforskellen mellem cis (cis) tættere på, hvilket gør det lettere at skifte mellem cis-trans konformationerne. Designere kan derved "inducere" molekyler til at folde sig til specifikke aktive konformationer eller danne intramolekylære hydrogenbindinger for at skjule polære grupper (yderligere lette penetration).
Dette immunsuppressivt middel er en lærebog om "synergistisk drift af specielle aminosyrer". Det er et cyklisk peptid med 11 rester, der indeholder 7 skelet-N-methyleringer og en D-alanin. Det er netop denne tætte N-methylering og ringslutning, der gør den i stand til at opretholde oral aktivitet, samtidig med at den har ekstrem stærk metabolisk stabilitet - den kan "skifte tøj" mellem vandig opløsning og membranmiljø, danne intramolekylære hydrogenbindinger for at skjule polariteten og passere gennem membranen, og derefter åbne for at binde sig til målet i den vandige fase. Cyclosporin er således blevet en af de få naturlige kilder til "beyond Rule of Five" makrocykliske peptider, der kan absorberes oralt.
N-methylerede aminosyrer er sterisk hindrende sekundære aminer med lav koblingseffektivitet, langsom reaktion og er meget tilbøjelige til racemisering og diketopiperazin (DKP) trunkering. Stærkere koblingsreagenser (såsom HATU/COMU + additiver), forlænget koblingstid eller dobbeltkobling, streng temperaturkontrol og online overvågning af hvert trin er påkrævet. Placeringsvalg er meget følsomt: N-methylering på forskellige steder af samme sekvens kan have vidt forskellige virkninger på aktivitet og penetration, og sted-for-sted screening er påkrævet.
N-methylering involverer hydrogen på nitrogenatomet. α-methylering involverer hydrogenet på α-carbonet. Når det oprindelige hydrogen på α-carbonet erstattes med en methylgruppe, ændres α-carbonet fra et "trisubstitueret" til et "tetrasubstitueret kvaternært carbon" (det mest typiske eksempel er Aib, 2-aminoisosmørsyre, som svarer til at tilføje en anden methylgruppe til alanins α-carbon, og er symmetrisk på begge sider). Dette medfører en tredobbelt effekt.
Konformationel låsning (mest kerne)
Antiprotease
Eliminer chirale svagheder
Naturlig GLP-1 skæres præcist fra den 8. position af N-terminalen af DPP-4 med en halveringstid på kun 1,5 til 2 minutter. Det vigtigste træk ved semaglutid er at erstatte alaninen (Ala8) i den 8. position med Aib (α,α-disubstitueret) - den steriske hindring af kvaternært kulstof gør DPP-4 "ude af stand til at bide" dette sted, hvilket blokerer den vigtigste nedbrydningsvej fra kilden.
Tre på hinanden følgende ændringer har forlænget halveringstiden fra minutter til en uge:
① Aib8 resid DPP-4 skæring;
② Arg34-erstatning undgår nedbrydning på et andet sted og er befordrende for den stedspecifikke lipidering.
③ Lys26 langkædet fedtdisyre (C18 disyre + linker) binder reversibelt til serumalbumin og undgår renal clearance.
Omfattende resultater: Halveringstiden er cirka 165 timer (ca. 1 uge), og den kan administreres en gang om ugen.
Aib er også en sterisk hindrende aminosyre med langsom kobling. Aib-aib eller AIB-efterfulgte aminosyrer kræver ofte dobbeltkobling eller stærk aktivering. Det er værd at bemærke, at den "unaturlige" status af Aib udgør hindringer for den rekombinante fermenteringsrute (ribosomer genkender den ikke). Derfor er peptider, der indeholder Aib, såsom Simaglutid, sædvanligvis afhængige af solid-fase syntese (SPPS) eller solid-fase + fermenteringshybridstrategier og kombineres med stedspecifik modifikation af fedtsyresidekæder. Kompleksiteten af proces- og kvalitetskontrol er væsentligt højere end for almindelige rekombinante peptider.
Den aktive lomme af protease er en "handske" skræddersyet til L-substrat. Når D-aminosyrer udskiftes nær spaltningsbindingen, forstyrres det geometriske forhold mellem substratets carbonylgruppe og den enzymkatalyserede triade. Spaltningsbindingen kan ikke placeres i den korrekte reaktionsposition, bindingsaffiniteten falder kraftigt, og hydrolysen stopper dermed.
Vend hele sekvensen, mens hver rest erstattes med en D-formet. Magien ligger i, at sidekædernes relative arrangement i rummet stort set bibeholdes, og dermed bevares den oprindelige aktivitet. Skelettet er dog fuldt D, fuldstændig immunt over for proteaser, og immunogeniciteten er væsentligt reduceret. Dette er et kraftfuldt værktøj til at designe blod-hjerne-barriere-shuttle-peptider og langtidsvirkende peptider.
Råvareprisen på D-aminosyrer er normalt højere end for L-typen, og der er færre leverandører. Opmærksomhed bør rettes mod kontrollen af chiral renhed (ee-værdi) og enantiomere urenheder.
Ud over de ovennævnte ændringer på skeletniveau, har farmaceutiske fagfolk også hundredvis af kommercialiserede "velbeskyttede og velaktiverede" ikke-naturlige aminosyrebyggeblokke at vælge imellem. De er ligesom lego, samlet i sekvenser efter funktion.
"Særlige aminosyrer" adresserer molekylær stabilitet og konformation. For at gøre polypeptider til orale lægemidler er der faktisk to uafhængige, men overlejrede veje til at "komme ind".
Den første fase: Overlev. Særlige aminosyrer (Aib, N-methyleret, D-type) modstår nedbrydning af gastrointestinale proteaser.
① Intrinsic Molecular Permeation: N-methylering reducerer hydrogenbindinger /PSA, ringslutning + hydrofobe sidekæder fremmer intramolekylære hydrogenbindinger og "kamæleon"-foldning.
② Fremme af præparatpenetration: SNAC, natriumdecanoat og TPE åbner/krydser midlertidigt den intestinale epitelbarriere.
Tredje trin: Bevar det fedtsyresidekædebindende albumin/langtidsvirkende konformation for at opretholde blodets lægemiddeleksponering.
Fremtidige molekyler vil indeholde flere og flere "tricky" ikke-naturlige aminosyrer og makrocykliske strukturer.
mRNA-display (såsom RaPID-systemet) kan screene peptidbiblioteker i skalaen 10¹² - 10¹³ på én gang.
RFdiffusion, modificeret AlphaFold (såsom den cykliske peptidpositionskodning af AfCycDesign) og forstærkningslæringsgeneratorer har været i stand til at designe store cykliske/bindende peptider fra bunden.
Sidekæde-olefinbindende låsende α-helix, hydrogenbindingssubstitution, β/γ-aminosyrefoldamer og skeletteknik på atomniveau løser gradvist det traditionelle problem med at målrette intracellulære protein-protein-interaktioner (PPI).
Anvendelsen af stedspecifikke konjugationssteder tilvejebragt af ikke-naturlige aminosyrer til at binde toksiner, nuklider eller fluorescens, hvilket konstruerer en "peptidversion ADC". Samtidig bliver teknologien til fremme af oral penetration stadig mere moden. "Særlige aminosyrer + præparater" vil gøre det muligt at tage flere polypeptider, der oprindeligt kun var injicerbare, oralt.
![tert-butyl (S)-2-(4-fluor-3,5-dimethylphenyl)-4-methyl-3-(2-oxo-2,3-dihydro-1H-imidazol-1-yl)-2,4,6,7-tetrahydro-5H-pyrazolo[4,3-c]pyridin-5-carboxylat](/upload/8820/tert-butyl-s-2-4-fluoro-3-5-dimethylphenyl-4-methyl-3-2-oxo-2-3-dihydro-1h-imidazol-1-yl-2-4-6-7-tetrahydro-5h-pyrazolo-4-3-c-pyridine-5-carboxylate-5455.webp "tert-butyl (S)-2-(4-fluor-3,5-dimethylphenyl)-4-methyl-3-(2-oxo-2,3-dihydro-1H-imidazol-1-yl)-2,4,6,7-tetrahydro-5H-pyrazolo[4,3-c]pyridin-5-carboxylat")
